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1 分子诊断及运动分子生物学
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分子诊断技术是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术,分子诊断是预测诊断的主要方法,其对象主要包括DNA、RNA和蛋白质。
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分子生物学的研究对运动生命科学的发展起着巨大的推动作用,在此基础上发展起来的运动分子生物学,是通过运用分子诊断技术,阐释运动过程中各种生命现象的机理,了解运动对机体影响的实质的科学。通过分子诊断技术基因多态性的研究可以尽早发现具有特殊竞技能力的人才,提高优秀运动员选材的准确性;还可以借此了解个体对运动训练的适应能力,制订个性化运动处方,提高训练的科学性;可以从分子水平上了解运动性疲劳产生的规律,开发用于预测运动员过度疲劳的基因芯片;转基因技术可以改造营养补充剂,使其更符合运动项目特点,实施运动营养药物的创新;基因治疗技术将用于运动损伤的治疗,加快运动损伤的康复,减少损伤的复发;对蛋白质的诊断有助于了解运动对蛋白三维结构和功能的影响,采用人工手段干预蛋白质的结构和功能,达到提高运动能力的目的。总之,分子诊断技术的发展必将大大推动运动分子生物学的进步,为运动训练科学化做出贡献。
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2 分子诊断在运动分子生物学中的应用
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2.1 运动相关疾病的临床预防诊断
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近年来,随着新的基因扩增技术不断发展,NASBA、3SR、SDA、RT-PCR、nest-PCR、multiplex PCR、PCR-RFLP、IEXPAR、AS-PCR、cDNA等新的特定基因检测技术不断涌现。随着运动分子生物学的不断发展,研究人员发现,一些运动相关疾病是由特定基因的多态性引起的,具有显著的遗传性,如心源性猝死、肌腱炎、手指腱鞘炎、韧带断裂等,这些运动损伤和疾病的发生不仅影响运动员的竞技能力和运动职业生涯,甚至危及健康和生命。
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BMP4由腱细胞产生,为肌腱提供稳定的定位点,能够降低过度运动对软组织产生的压力[1],FGF3、FGF10和FGFR1相互作用有促进有丝分裂、细胞迁移、分化和伤口愈合等多种生物学功能[2]。Salle等人[3]研究了138名18岁和35岁之间、每天接受4-5小时训练的排球运动员的肌腱状况,通过核磁共振成像观察有疼痛反应的运动员的肌腱髌骨、脚踝、肩胛和髋外展肌等处的肌腱,并从其中提取唾液样本的DNA,使用TaqMan实时定量PCR比较组间基因型差异。发现BMP4和FGF3基因单倍型与运动员肌腱病变高度相关,FGF10基因参与肌腱病变过程,FGFR1基因多态性与肌腱病变无相关性。
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前交叉韧带断裂(ACL)是最严重的骨骼肌软组织损伤之一,然而产生这种伤病的机制尚未明确。Posthumus等人[4]发现存在间质金属蛋白酶的染色体11q22片段与ACL的发病有密切关系。Raleigh等人[5]通过研究126名欧洲人种ACL病患者和214名对照者发现,GDF5基因的多态性位点(rs143383)和ACL跟腱病变的风险相关。Posthumus等人[6]对129名(女性38名)ACL疾病患者组和216名(女性83名)正常对照者进行研究,所有参与者进行COL12A1基因分型ALU1和BSRI限制性片段长度多态性(RFLP)分析。研究结果表明,ALU1限制性片段长度多态性的AA基因型与女性患ACL疾病的风险相关联,与男性无关联性;BSRI限制性片段长度多态性基因表达与ACL疾病风险不相关。
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扳机指的发病往往归因于第一环状韧带损伤,但Lundin等人[7]发现,其病变部位出现与跟腱炎或肌腱炎类似的变化,因此,推测手指肌腱在病变时会和跟腱炎出现相似的基因表达差异。对13名病患者及13名正常对照者的10组(胶原蛋白型1a1、 collagen 3a1、MMP-2、MMP-3、ADAMTS-5、TIMP-3、双链蛋白聚糖、双糖链蛋白多糖、核心蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖)基因表达进行差异化分析,在病患的手指肌腱,胶原蛋白型1a1和3a1、双链蛋白聚糖和双糖链蛋白多糖均显著性上调,MMP-3和TIMP-3显著性下调,其余四个基因没有显著改变,这种基因表达的改变支持扳机指属于肌腱病变的理论,为临床上应用外科手术治疗肌腱病变提供了参考。
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运动猝死与多种遗传性心脏疾病有关。Shah等人[8]以2 847名实验参与者为模型,研究了NOS1AP基因28个SNPs位点,结果表明,欧洲人的NOS1AP基因与QT间期的关联性比其他种族更为显著,每一次rs1932933等位基因的复制都会相应延长QT间期(4.9msec,P=7.20×10-7)。黄京璐等人[9]通过研究60例不明原因猝死人群和80例正常人群的NOS1AP部分SNP位点,发现NOS1AP第6外显子区域的s3751284位点可能是不明原因猝死的易感基因位点。Koskela等人[10]通过对1 963例芬兰志愿者进行运动测试,发现体育运动对心源性猝死有一定的诱导作用。
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2.2 运动诱导骨骼肌适应及相关疾病的诊断
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表1 与miRNAs相关的骨骼肌疾病[13]
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骨骼肌功能疾病主要包括肌营养不良症、多发性肌炎、线粒体肌病、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌强直、炎症性肌肉疾病及先天性肌病等,近年研究发现,miRNAs异常可能是引发或延缓这些疾病的原因。
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McCarthy等人[11]通过诱导小鼠骨骼肌肥大试验,发现在小鼠的跖肌和比目鱼肌特异性miRNAs中,miR-206的表达不变,miR-1和miR-133的表达却都下降了50%,首次证明了肌肉特异性miRNAs对骨骼肌肥大有一定作用。
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肌肉萎缩症是一类以消瘦虚弱肌肉为特征的遗传疾病,McCarthy等人[12]通过后肢悬挂诱导肌肉萎缩研究大鼠比目鱼肌miRNAs的表达变化,实验后发现18种miRNAs的表达有明显变化,推测其机制可能为通过miRNA-499间接调控b-肌球蛋白抑制子(sox6)的表达。
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肌营养不良症是一种原发于肌肉的遗传性变性疾病,组织学特征为肌纤维坏死、再生和脂肪及结缔组织增生。Greco等人[14]通过比较mdx小鼠与野生型小鼠、Duchenne型肌营养不良患者与正常人骨骼肌组织中表达改变的miRNA,发现有11个miRNA在mdx小鼠和Duchenne型肌营养不良患者中有类似的表达改变。
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肌萎缩侧索硬化症(渐冻人症)是运动神经元病的一种,在ALS动物模型运动元再生过程中,miR-206调控HDAC4发挥着关键作用。Williams等人[15]发现在ALS模型小鼠中miR-206表达显著增加。Velleca等人[16]发现在骨骼肌发育过程中,miR-206分子的前体在运动终板形成区域呈现优势表达分布。
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2.3 运动员选材
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运动能力受遗传因素影响很大。当前,有超过200个染色体位点和18个线粒体DNA多态性位点被发现与人的肌肉力量、体力活动水平、耐力水平和个人训练效果相关。
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De Moor等人[17]通过GWAS分析研究了荷兰及美国人的体力活动水平,发现位于3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸合成酶2基因的rs10887741与体力活动水平关联最大。夏小慧[18]发现AMPKa2基因rs2796516位点G等位基因、rs2746342-rs11206889位点AC单体型等基因可能是优秀长跑运动员的分子标记。
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对著名的“冠军基因”α-辅肌动蛋白3(ACTN3)基因第577密码子进行的多态分析是肌肉力量遗传学研究中的经典。陈伟民等人[19]采用等位基因特异性PCR法扩增目的基因, 建立了灵敏、快速的ACTN3-C17基因多态性检测方法。
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人类最大有氧耐力的遗传度为30%—80%,目前被细致描述的与耐力素质相关的基因位点共有49个,但由于受样本量、种族差异、地域差异等影响,大部分位点的确切效应并不明确。邓潇潇等人[20]发现12 722位点T等位基因与马拉松跑能力有关联。Thomaes等人[21]发现GPS对预测冠心病患者最大摄氧量训练效果增加与否效果显著,而位于AMP脱氨酶1基因、睫状神经营养因子基因和糖皮质激素受体基因的rs1800169、rs17602729、rs6190与耐力水平变化有关。杨晓琳等人[22]发现G1357A多态位点GG基因型可以作为中国女性优秀举重运动员选材用候选分子遗传学标记。吴剑[23]发现UCP2基因3’-UTR 45bp Ins/Del DD型与有氧运动能力有关;OGDHL基因rs 1268722AA型与超长跑有氧运动能力有关;ACSL4基因rs5943427GG型、rsl324805TT型、rs5943427-rsl324805(GT)单体型与男子长跑运动员有氧运动能力有关。
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续表
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2.4 基因兴奋剂的检测
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Else:Transcription factor Pax7gene(Pax7protein:One paired domain made up with 128amino acids),FATP1gene(FATP),CD36gene,Insulin receptor gene,GLUTs gene(Glucose transport protein).
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国际反兴奋剂组织将基因兴奋剂定义为以非治疗目的用于提高运动员运动能力的基因、遗传元件和(或)细胞。利用基因治疗的手段可以使运动员获得竞技优势。但由于基因治疗技术尚不成熟,基因兴奋剂无法控制插入的目的基因,导致细胞的某些机能失常,因此存在很多危害。例如EPO的使用可导致高血压,hGH过量可导致肿瘤,IGF-I可导致肌肉过度生长、结缔组织损伤等症状。还有一类基因兴奋剂为重组蛋白,其与内源蛋白结构极为相似,造成检测非常困难。目前发现的有EPO、HIFs、CERA、ACE、hGH、IGF-I、MGF、FGF、VEGF、PPAR-δ、Myostatin Leptin、Follistatin等90余个潜在具有兴奋剂作用的基因。检测基因兴奋剂的方法主要是检测常规生化指标、导入基因和表达蛋白质等方法,以及用基因表达谱、蛋白质谱、代谢谱、活体成像等新技术检测目的基因及蛋白质。
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肖卫华等人[24]通过常规PCR多管扩增技术建立了实时定量RT-PCR法检测机械生长因子(MGF)基因表达。结果表明,荧光定量RT-PCR法能绝对定量MGF兴奋剂基因表达水平,相关系数大于0.99。
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吕国平等人[25]建立了PPAR-δ高通量筛选模型,通过检测萤光素酶基因表达状况评价化合物对目的基因的激动活性,此模型方法灵敏稳定,可用于筛选PPAR-δ的激动剂。
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重组人促红细胞生成素(rhEPO)和重组人生长激素(rhGH)等已被国际奥委会禁用,通过免疫分析法可以测定血清中的EPO浓度,其中以酶联免疫分析、化学发光免疫分析和放射免疫分析为主。
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Kawasaki等人[26]将LC-MS及石墨化碳柱结合,可对CHO细胞表达的rhEPO各种糖基化位点、与位点特异性直接相关的糖微观不均一性、糖的结构进行分析,以及鉴别出BHK细胞表达的rhEPO所特异具有的硫酸化N-连接多糖部分。
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3 结论与展望
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在运动相关疾病的临床预防诊断中,我们发现某些特定基因的多态性能够引起一些运动相关疾病,然而,还需要进行大量不同种族、不同人群、不同运动方式的研究,包括检测方法的研究、功能学研究等,以阐明蛋白质在筋腱修复过程中的机制、筋腱的衰退过程等。这项工作的开展能够提供分子生物学科研的新视角,为发掘副作用小、疗效好的新型治疗方法提供参考,一旦发现运动员有潜在伤病危险,教练和队医可以通过外部干预和调整训练计划来规避风险。
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骨骼肌疾病是世界性健康问题,近年来很多研究阐明了一些miRNAs在骨骼肌疾病中的作用机制,大部分集中在遗传和神经性骨骼肌疾病中,而对其他骨骼肌疾病研究很少,我们应该更进一步地探索miRNAs对骨骼肌疾病的作用,使得科研覆盖面更广、医疗应用性更强。
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分子诊断技术在运动能力遗传学上应用的研究越来越多,人们对运动遗传学的理解也不断加深,但多数研究都仅针对不同种族、不同人群中已知基因位点与运动能力关联性的重复检验,而新基因、新位点的探索却渐入瓶颈。在对基因多态性影响运动能力的研究中,一些基因可以作为预测某种运动能力强弱的遗传标记,但其基因型影响人体运动能力的机制尚不明确,如ACE基因就是现在国内外研究比较深入的基因之一,很多研究表明ACE基因与人体有氧运动之间存在显著相关性,但是也有很多研究不支持此观点,J.R.Ruiz[1]等人通过研究发现,并没有充分的证据表明ACTN3基因能够促进西班牙游泳运动员的运动能力,GUAN WANG等人[2]也持同样观点。另有一些研究表明,某种运动的优势基因,对于另一种运动可能是劣势基因,Sigal Ben-Zaken[27]等人研究发现,IGF-IR AA基因多态性有利于耐力型运动,但对于力量型运动则表现出不利的影响。笔者相信,随着各种分子生物学技术的日益成熟、国际间合作的不断增多及统计学方法的不断创新,与运动能力有关的新基因、蛋白及机制研究将大量涌现,人们将能够更系统、全面地描绘运动能力的遗传图谱。
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反基因兴奋剂需要不断关注基因治疗技术的研究进展,及时对基因兴奋剂检测研究制订针对性目标,才能最大限度地缩小两者出现的时间差。同时,基因兴奋剂的检测涉及化学、医学、生物学等多个研究领域,针对基因兴奋剂检测中的系列问题,需要充分利用光谱和电化学、免疫技术、核酸杂交技术结合质谱等手段,不断发展新的技术应用于基因兴奋剂的检测,例如分子成像技术、生物传感器技术以及更先进的分析软件等,才能不断更新高灵敏度的分析方法,并建立检测新型基因兴奋剂的方法。
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摘要
近年来,随着新的分子诊断技术的不断发展,从分子水平上评价运动员在调整期、训练期和比赛期的体质、状态已成为可能。分子诊断技术早在2000年就应用于国内的竞技体育科研中,其主要应用在运动员选材、运动疲劳机理、运动诱导骨骼肌适应、基因治疗技术、基因兴奋剂检测等几方面。总结了各种新的分子诊断技术在运动分子生物学科研中的应用原理及优缺点,并指出未来其发展方向将侧重于以下几方面:①快速、简便的等位基因检测方法在运动员选材和运动遗传病筛查中的应用;②应用基因技术对运动员选材的地域和种族多态性进行划分;③基因兴奋剂检测技术的革新。
Abstract
In recent years, with the continuous development of new molecular diagnostic techniques, it has become possible to evaluate physique and athletic state of athletes at the molecular level during the adjustment, training, and competition periods. Molecular diagnostic techniques were applied to domestic sports scientific research as early as the year of 2000, and its application mainly lie in athlete selection, mechanism of sports fatigue, exercise-induced skeletal muscle adaptation, gene therapy, gene doping detection. This article summarizes a variety of application principles of new molecular diagnostic techniques and their advantages and disadvantages in sport molecular biology researches, and puts forward that in the future, the following directions of its development should be focused on: (1) Application of rapid and easy allelic gene detection method in athlete selection and sports genetic disease screening; (2) Application of gene techniques in dividing the regional and ethnic polymorphism of athlete selection; (3) Innovation of gene doping detection techniques.